De Hortus Botanicus Amsterdam is een zelfstandige, onafhankelijke stichting die de grond en gebouwen, waarvan de meesten monumentaal zijn, in eigendom heeft en dus ook voor eigen rekening onderhoudt. Veruit het grootste gedeelte van het benodigde geld verdient de Hortus door opbrengsten uit de horeca, winkel en entree, de verhuur van zalen, giften van particulieren en sponsoring door bedrijven. Sinds de verzelfstandiging in 1987 kent de Hortus ook een actieve Vriendenvereniging met meer dan 8.000 leden. Ook de opbrengst van de jaarlidmaatschappen levert een belangrijke bijdrage aan de exploitatie.
Onder de Stichting Hortus Botanicus Amsterdam zijn ongeveer 35 personen werkzaam, verdeeld over het tuinteam, kantoor en horeca. Daarnaast is er een onmisbare pool van circa 80 vrijwilligers die de Stichting ondersteunen bij werkzaamheden in educatie, tuinonderhoud, rondleidingen en bij de winkel en portier.